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在器官移植中，亟需非侵入性生物標(biāo)志物平臺來監(jiān)測免疫排斥反應(yīng)。來自賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院的研究人員假設(shè)移植組織將供體特異性外泌體釋放到受體循環(huán)中，并且供體外泌體成分的定量和分析或可作為監(jiān)測排斥反應(yīng)的生物標(biāo)志物平臺。該研究在人類到小鼠異種胰島移植模型中測試了這個(gè)假說，并在臨床的胰島和腎移植中進(jìn)行了驗(yàn)證。在異種移植模型中，使用抗HLA（human-specific MHC class I）抗體進(jìn)行長期隨訪定量檢測受體血液中移植的胰島來源的外泌體（僅在人胰島的異種移植受體中可檢測到）。使用抗HLA抗體偶聯(lián)的磁珠純化移植的胰島來源的外泌體，其成分含有胰島內(nèi)分泌激素標(biāo)志物胰島素、胰高血糖素和生長抑素。免疫排斥導(dǎo)致移植的胰島來源的外泌體信號的明顯減少以及在高血糖出現(xiàn)之前外泌體miRNA和蛋白質(zhì)組的不同變化。在臨床的胰島和腎移植中，具有各自組織特異性的胰島β細(xì)胞和腎上皮細(xì)胞的供體外泌體在為期5年以上的隨訪受體血漿中均可確切檢測到?？偠灾@些發(fā)現(xiàn)證明了外源移植物來源的外泌體作為生物標(biāo)志物的潛力，為移植組織的條件狀態(tài)提供了非侵入性窗口。

下面是文獻(xiàn)的詳細(xì)解讀：

如圖1，研究人員利用無胸腺的糖尿病小鼠移植人的胰島的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用Nanosight的光散射和熒光模式檢測了外泌體的顆粒大小分布和MHC信號（anti–HLA-A和anti–HLA-C），所有進(jìn)行胰島移植的小鼠血液中均檢測到了供體來源的 HLA外泌體信號。Western在外源胰島樣本中檢測出微弱的HLA-A信號。接種白細(xì)胞誘導(dǎo)免疫排斥的胰島移植組（R-xeno）血漿中外泌體的濃度與未誘導(dǎo)免疫排斥的胰島移植組（N-xeno）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是R-xeno組的血漿中HLA陽性的外泌體濃度較N-xeno組明顯降低。

圖 1.移植的人類胰島釋放供體來源的外泌體進(jìn)入受體的循環(huán)中

接著發(fā)現(xiàn)，移植胰島的小鼠在接種同源白細(xì)胞后HLA陽性外泌體信號明顯下降（相比接種安慰劑組），并且在接種7天后空腹血糖急劇上升。葡糖糖耐受實(shí)驗(yàn)顯示，8只動物中有3只在第6天葡糖糖耐受能力受損。在這些過程中外泌體的濃度和大小均無明顯改變。組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在第5天由于大量的T細(xì)胞浸潤，誘導(dǎo)免疫的移植胰島受到破壞。誘導(dǎo)免疫反應(yīng)后，血漿中T細(xì)胞外泌體（CD3陽性）一直維持在較高水平。

圖 2.移植的胰島來源的外泌體的表征可預(yù)示早期急性的免疫排斥反應(yīng)

接著就是外泌體的分離提取和成分分析了，電鏡圖是必須的了。β細(xì)胞標(biāo)志物FXYD2 在N-xeno組和人胰島培養(yǎng)組的外泌體中與HLA-A共表達(dá)。供體與受體的MHC mismatch 使我們能夠從受體血漿中純化人胰島細(xì)胞特異來源的外泌體。免疫排斥導(dǎo)致胰島外泌體中內(nèi)分泌激素胰島素的下降。

圖 3. 移植的胰島源外泌體的純化及其內(nèi)含物的成分分析

研究人員對純化的移植胰島源外泌體（transplant islet–specific exosomes, TISEs） 與移植的胰島（即其來源細(xì)胞/組織）進(jìn)行的蛋白質(zhì)和RNA成分的對比分析。篩選出了一堆差異表達(dá)的miRNAs。

Figure 4. TISEs的蛋白質(zhì)和RNA成分分析

表 1.血糖量正常的移植胰島小鼠的移植胰島和TISEs表達(dá)豐度最大的25個(gè)miRNAs

表 2.與移植胰島相比，TISEs表達(dá)差異最大的miRNAs

免疫排斥反應(yīng)會導(dǎo)致TISE成分的改變。如與N-xeno組外泌體相比，R-xeno組外泌體angiopoietin-1 (A), HSC70 (B), hemopexin (C), 和 complement C3 (D) 四個(gè)蛋白表達(dá)有差異。

圖 5. N-xeno組外泌體與R-xeno組外泌體相比差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

那么在臨床上，外泌體與免疫排斥的相關(guān)性如何呢？研究人員取得5例Ⅰ型糖尿病移植胰島的患者的血漿樣本，我們可以看到在B–D 3個(gè)病人中, 供體HLA外泌體信號一直處于穩(wěn)定水平，但是在病人 A中HLA外泌體信號在約100天后一直在下降，最終下降至0.35以下，血糖在800-1000天時(shí)急劇上升（而C肽/葡糖糖比值仍然正常）。同時(shí)該病人β細(xì)胞特異抗原谷氨酸脫羧酶65（GAD65）的抗體顯著上升。

圖 6. 人同種異體來源的胰島移植的移植胰島源外泌體的長時(shí)程定量分析

上面的臨床相關(guān)性做完后，接著，研究人員檢測了TISE成分是否可以在臨床樣本中純化并檢測？該患者由于在移植期的加速急性排斥反應(yīng)而導(dǎo)致β細(xì)胞功能喪失（圖7A）。首先，確認(rèn)所有測試的血漿樣品富含外泌體（圖7B）。接下來，使用供體特異性HLA-A2抗體，證實(shí)移植后移植胰島外泌體可檢測到，但在移植前檢測不到（圖7C）。移植胰島外泌體對FXYD2的共表達(dá)是高度陽性的（圖7D），并顯示了在移植后第2天血漿樣品中胰島素、胰高血糖素、生長抑素和FXYD2蛋白的表達(dá)（圖7E），與患者中高血糖癥的校正相關(guān)（圖7A）。RNA成分分析顯示胰島素、胰高血糖素、生長抑素和FXYD2的表達(dá)，其在移植前樣品中是不可檢測的（圖7F）。供體外泌體的血漿分析顯示在產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)后HLA-A2信號是陰性的（圖7G），并且也在Western印跡上驗(yàn)證（圖7H）。

圖 7. TISE成分可在人同種異體胰島移植的受體血漿中檢測到

總之，這些研究結(jié)果表明，在臨床胰島移植中，可以使用供體HLA特異性抗體從受體血漿成功地進(jìn)行供體胰島外泌體定量和表征。類似于小鼠胰島移植模型，供體胰島外泌體共表達(dá)胰島表面標(biāo)記物，及移植胰島的細(xì)胞特異性的組分。

該研究為臨床上器官移植后的免疫排斥反應(yīng)提供了十分有潛力的預(yù)后生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：Vallabhajosyula P, Korutla L, Habertheuer A, Yu M, Rostami S, Yuan CX, Reddy S, Liu C, Korutla V, Koeberlein B, Trofe-Clark J, Rickels MR, Naji A. Tissue-specific exosome biomarkers for noninvasively monitoring immunologic rejection of transplanted tissue. J Clin Invest. 2017 Mar 20. pii: 87993. doi: 10.1172/JCI87993. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 28319051. IF=12.575

原文鏈接：http://www.exosome.com.cn/thread-1477-1-1.html

文章來源于外泌體資訊網(wǎng)