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   Clark等人使用串聯(lián)質(zhì)譜標記技術(shù)（tandem mass tagging ,TMT）聯(lián)合支持向量機（support vector machine，SVM）多變量聚類分析來識別乳腺癌外泌體的蛋白質(zhì)組。為了能夠充分展示液體活檢診斷潛力，該團隊提出了一個工作流程，既可以完成蛋白質(zhì)鑒定，并可以確保無雜蛋白污染物的干擾。

   外泌體是由細胞釋放的小泡。癌癥外泌體里包含了mRNA、miRNA以及其它蛋白質(zhì)，包括一些參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的原癌基因和蛋白。外泌體的典型結(jié)構(gòu)是尺寸40-130納米的杯狀形態(tài)，這些囊泡在血液中循環(huán)，并可能是液體活檢診斷的循環(huán)癌標記物。臨床醫(yī)生可能會根據(jù)血檢結(jié)果來診斷和鑒定癌癥，監(jiān)測對治療的反應(yīng)，以及提供預后建議。

  然而，鑒別蛋白質(zhì)組是很困難的，因為從細胞本身非外泌體來源的蛋白質(zhì)或其他因素會干擾實驗結(jié)果。出于這個原因，研究人員通常使用富集技術(shù)，諸如免疫、超離和電子顯微鏡（EM）來制備樣品和驗證結(jié)果。

   Clark等人利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS / MS）的方法，將樣品制備過程中產(chǎn)生的各種富集的蛋白質(zhì)做了直接比較。研究人員推測，他們可以很容易地通過該比較確定外泌體的蛋白質(zhì)，因為它們僅僅在富集的部分存在。研究材料是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系SKBR3B的24小時培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）。

   首先，該團隊根據(jù)以下離心和濃縮過程，收集了三個組分的無細胞上清液，每一部分都有相應(yīng)的外泌體物質(zhì)的積累：

   10 K pellet：Centrifuge at 10,000 xg for 30 minutes 

   100 K pellet：Centrifuge at 100,000 xg for 70 minutes 

Opti pellet：利用密度梯度法，通過外泌體特異的標志物篩選外泌體

   每部分收集好之后，Clark等人按照標準胰酶消化的步驟進行。肽段樣品制備好后，加入TMT標記試劑并利用Orbitrap XL質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）進行LC-MS/MS分析。

   接下來研究人員獲得了光譜數(shù)據(jù)，他們確定了三個實驗組分的蛋白質(zhì)和測量豐度。他們還比較了從傳統(tǒng)的尺寸排阻色譜獲取的外泌體富集的樣品，并使用免疫印跡鑒定蛋白質(zhì)。該團隊還通過電子顯微鏡觀察了典型的大小和形態(tài)的外泌體。

   驗證了這一方法學之后，Clark等人建立SVM聚類分析以確定外泌體的起源。他們分析了LC-MS/MS的2179蛋白質(zhì)；通過SVM聚類分析得到了5個外泌體和8個非外泌體的蛋白標記，以及251蛋白質(zhì)是外泌體蛋白質(zhì)組來源的。

   作為進一步的驗證步驟，研究人員重新分析了數(shù)據(jù)，量化的12種質(zhì)膜標記物，可能可以反映出在富集外泌體中的部分碎片和蛋白污染水平。他們發(fā)現(xiàn)，只有整合素α-V和CD151會在外泌體蛋白中聚集，但SVM分析里概率很低。

   綜上，Clark等人對該乳腺癌外泌體蛋白質(zhì)組的識別方法很有信心，而且可以識別混合的雜蛋白。另外，他們認為對該方法進行修改，以便成為其他癌癥外泌體的檢測工具。

   參考文獻：Clark DJ, Fondrie WE, Liao Z, Hanson PI, Fulton A, Mao L, Yang AJ. (2015) Redefining the Breast Cancer Exosome Proteome by Tandem Mass Tag Quantitative Proteomics and Multivariate Cluster Analysis. Anal Chem 87(20):10462-9.

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