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糖尿病足（diabetic foot ulcers, DFUs）的高截肢率和高死亡率給患者和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。加速創(chuàng)面愈合被認(rèn)為是減少DFUs截肢的關(guān)鍵。

近日，重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院鄧武權(quán)教授團(tuán)隊(duì)研究生陳天怡和宋佩陽(yáng)在Burns&Trauma雜志在線(xiàn)發(fā)表題為“Sphingosine-1-phosphate derived from PRP-Exos promotes angiogenesis in diabetic wound healing via the S1PR1/AKT/FN1 signalling pathway”的研究成果（2023 May 23;11:tkad003），結(jié)果證實(shí)磷酸鞘氨醇-1（sphingosine-1-phosphate, S1P）高富集于富血小板血漿源性外泌體（exosomes derived from platelet-rich plasm, PRP-Exos）。在高糖環(huán)境下，PRP-Exos可通過(guò)結(jié)合皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的磷酸鞘氨醇-1受體1（S1P receptor 1, S1PR1），傳遞S1P信號(hào)，激活A(yù)KT/FN1通路，從而發(fā)揮促血管新生與促創(chuàng)面修復(fù)的作用。

鄧武權(quán)教授團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于PRP及其衍生物的臨床治療和機(jī)制探討，成果發(fā)表在Signal Transduct Target Ther、Cell Transplant、Infect Drug Resist、Front Bioeng Biotechnol等。但是受限于自體PRP來(lái)源有限、異體PRP存在可能的免疫反應(yīng)，以及PRP本身不具備靶向作用等，PRP治療有待進(jìn)一步優(yōu)化。近年來(lái)，PRP-Exos在組織再生領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。由于PRP-Exos具備低免疫原性、跨器官通訊能力以及靶向修復(fù)等優(yōu)勢(shì)，是PRP療法的優(yōu)化替代方案。

該研究通過(guò)透射電鏡、納米流式示蹤以及Western blotting對(duì)PRP-Exos進(jìn)行了特異性鑒定。隨后開(kāi)展了PRP-Exos干預(yù)糖尿病小鼠創(chuàng)面的研究（圖1），證實(shí)PRP-Exos顯著地促進(jìn)了糖尿病小鼠創(chuàng)面閉合率（P<0.01）。H&E染色的結(jié)果表明，PRP-Exos顯著促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面再上皮化程度（P<0.01）。通過(guò)對(duì)創(chuàng)緣組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31進(jìn)行免疫熒光染色，證實(shí)PRP-Exos顯著地促進(jìn)了CD31的免疫熒光強(qiáng)度（P<0.05）。因此，PRP-Exos被認(rèn)為可顯著地發(fā)揮促創(chuàng)面修復(fù)的效應(yīng)。

  圖1.（a-b）對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)緣部位進(jìn)行NC、PRP-AS以及PRP-Exos干預(yù)后，繪制了具有代表性的創(chuàng)面閉合大體圖以及模式圖（n=5）。（c）通過(guò)對(duì)創(chuàng)面閉合率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較PRP-Exos與PRP-AS，以及PRP-Exos與NC之間的差異情況。（d-e）H&E染色及其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。（f-g）對(duì)血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31進(jìn)行免疫熒光染色。****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05。

隨后，作者開(kāi)展了PRP-Exos干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的體外研究（圖2）。首先，通過(guò)外泌體吞噬實(shí)驗(yàn)證實(shí)，被PKH26標(biāo)記的PRP-Exos，在六小時(shí)內(nèi)通過(guò)胞吞作用進(jìn)入到HUVECs胞內(nèi)。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)探索PRP-Exos干預(yù)HUVECs的結(jié)果表明，在高糖環(huán)境下，PRP-Exos處理HUVECs的最適作用時(shí)間是18小時(shí)。在確定PRP-Exos處理HUVECs的最適作用時(shí)間節(jié)點(diǎn)后，通過(guò)CCK-8、EdU增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期等證實(shí)，PRP-Exos可顯著促進(jìn)HUVECs的增殖能力（P<0.05）；通過(guò)transwell、活細(xì)胞工作站觀(guān)察細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PRP-Exos可顯著促進(jìn)HUVECs的遷移能力（P<0.0001）；通過(guò)成管實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PRP-Exos可顯著促進(jìn)HUVECs的管形形成能力（P<0.0001）。

圖2.（a）外泌體吞噬實(shí)驗(yàn)。（b）CCK-8實(shí)驗(yàn)用來(lái)探索PRP-Exos處理HUVECs的最適時(shí)間。（c）EdU實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)PRP-Exos處理HUVECs后的增殖情況。（d）CCK-8實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)PRP-Exos處理HUVECs后的細(xì)胞活力情況。（e）通過(guò)流式細(xì)胞儀，檢測(cè)PRP-Exos處理HUVECs后的細(xì)胞周期情況。（f-g）通過(guò)活細(xì)胞工作站連續(xù)觀(guān)察PRP-Exos干預(yù)HUVECs后的遷移情況。（h-i）Transwell實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)HUVECs的遷移能力。（j-k）血管形成實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)PRP-Exos處理HUVECs后的管形形成情況。（l-m）血管形成實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)shS1PR1、PRP-Exos、S1P等處理HUVECs后的管形形成情況。****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05，ns表示沒(méi)有顯著性差異。

通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRP-Exos以及其對(duì)照組PRP-AS中S1P的含量，證實(shí)S1P主要富集在PRP-Exos中。并且，RT-qPCR的結(jié)果證實(shí)，S1PR1的表達(dá)量在糖尿病患者和動(dòng)物皮膚組織中顯著升高（圖3）。作為高糖環(huán)境下S1P信號(hào)結(jié)合的主要受體，S1PR1被認(rèn)為起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

圖3.（a）通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度PRP-Exos、PRP-AS以及NC中的S1P含量。（b）RT-qPCR量化分析糖尿病與非糖尿病患者皮膚組織中的S1PR1-3的差異表達(dá)。（c）RT-qPCR量化分析糖尿病與非糖尿病小鼠皮膚組織中的S1PR1-3的差異表達(dá)。（d）生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Human Protein Atlas中的數(shù)據(jù)表明，在正常人體皮膚中，S1PR1高富集于內(nèi)皮細(xì)胞中。（e-f）通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)NG、HP與HG中S1PR1-3的表達(dá)情況。****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01，ns表示沒(méi)有顯著性差異。

因此，通過(guò)構(gòu)建shS1PR1的HUVECs細(xì)胞株，作者開(kāi)展了更為深入的研究。Western blotting的結(jié)果證實(shí)，PRP-Exos可顯著上調(diào)磷酸化AKT、促血管因子VEGF-A以及組織測(cè)序結(jié)果篩選出來(lái)的纖維連接蛋白-1（fibronectin 1, FN1）的表達(dá)量（圖4）。但是，當(dāng)PRP-Exos干預(yù)shS1PR1的HUVECs時(shí)，前者對(duì)磷酸化AKT、VEGF-A和FN1的顯著上調(diào)效果大打折扣。隨后的shS1PR1腺病毒干預(yù)糖尿病小鼠創(chuàng)面閉合的研究中同樣證實(shí)，當(dāng)S1PR1的表達(dá)量受到抑制時(shí)，糖尿病小鼠的創(chuàng)面閉合率顯著降低。并且，當(dāng)PRP-Exos傳遞S1P信號(hào)無(wú)法被S1PR1成功接收時(shí)，其促創(chuàng)面閉合效果也受到明顯阻滯。因此，在高糖環(huán)境下，PRP-Exos來(lái)源的S1P依賴(lài)于結(jié)合S1PR1，從而發(fā)揮顯著地促血管新生與促創(chuàng)面修復(fù)效應(yīng)。

圖4.（a）組織蛋白測(cè)序結(jié)果，F(xiàn)N1在糖尿病患者皮膚中顯著下調(diào)。（b）生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Human Protein Altals的數(shù)據(jù)表明，在正常人皮膚中，F(xiàn)N1在內(nèi)皮細(xì)胞存在高表達(dá)。（c-f）在不同干預(yù)后，F(xiàn)N1，p-AKT，VEGF-A的表達(dá)量被蛋白免疫印跡法檢測(cè)并量化分析。（g-k）在不同干預(yù)后，F(xiàn)N1、p-AKT、VEGF-A和S1PR1的表達(dá)量被蛋白免疫印跡法檢測(cè)并量化分析。****P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01。

隨后，作者通過(guò)使用AKT磷酸化抑制劑LY294002和AKT磷酸化激活劑SC79證實(shí)，在高糖環(huán)境下，PRP-Exos可通過(guò)結(jié)合S1PR1傳遞S1P信號(hào)，從而激活磷酸化AKT通路，促進(jìn)下游FN1和VEGF-A的表達(dá)（圖5）。在后續(xù)研究中，作者使用了靶向結(jié)合FN1的siRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)FN1表達(dá)的抑制。當(dāng)FN1表達(dá)量受到抑制時(shí)，HUVECs合成與分泌VEGF-A的含量也呈明顯下降的趨勢(shì)。該研究證實(shí)，F(xiàn)N1不僅可以作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)支持作用，同樣可以作為調(diào)控蛋白參與到VEGF-A的調(diào)節(jié)中。

圖5.（a-h）在不同處理后，F(xiàn)N1、p-AKT、VEGF-A的表達(dá)量被蛋白免疫印跡法檢測(cè)并量化分析。（i-l）細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)不同處理后FN1的免疫熒光強(qiáng)度情況。***p < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05。

該研究初步探索了PRP-Exos來(lái)源的S1P在糖尿病創(chuàng)面修復(fù)中的作用和潛在分子機(jī)制。揭示了高糖環(huán)境下，PRP-Exos來(lái)源的S1P可通過(guò)S1PR1/AKT/FN1通路促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面修復(fù)。這項(xiàng)研究結(jié)果，可為未來(lái)臨床開(kāi)展PRP-Exos治療DFUs提供理論依據(jù)，具有重要的轉(zhuǎn)化作用。

參考文獻(xiàn)：

Sphingosine-1-phosphate derived from PRP-Exos promotes angiogenesis in diabetic wound healing via the S1PR1/AKT/FN1 signalling pathway. Burns Trauma. 2023;11:tkad003.

文章轉(zhuǎn)載自外泌體之家

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