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   Methods in Molecular Biology系列最新一版關(guān)于Preeclampsia（子癇前期）的專版中，其中有4篇與外泌體相關(guān)。分別介紹了從細(xì)胞培養(yǎng)液與體液中富集外泌體、從母體循環(huán)中分離胎盤(pán)特異性外泌體、利用體外培養(yǎng)人胎盤(pán)外植體體系提取胎盤(pán)細(xì)胞外囊泡、外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析的方法。

   一、從細(xì)胞條件培養(yǎng)基和生物體液中富集外泌體

   Sharma, S., et al. (2018). "Methods to Enrich Exosomes from Conditioned Media and Biological Fluids." Methods Mol Biol 1710: 103-115.

   外泌體這種納米囊泡可以運(yùn)輸各類分子，包括但不限于蛋白質(zhì)和miRNA。外泌體的這種能力使其在細(xì)胞通訊中有重要作用，會(huì)引發(fā)靶細(xì)胞的生物學(xué)變化。它們?cè)诖龠M(jìn)正常的生物學(xué)過(guò)程（如免疫應(yīng)答和懷孕）方面有些功能。然而，它們也與包括癌癥和妊娠并發(fā)癥（如先兆子癇）在內(nèi)的病理狀況有關(guān)。要了解外泌體在先兆子癇中的作用，就得建立有效的純化和表征外泌體的方法。目前已有幾種技術(shù)提出了濃縮外泌體的方法，如超速離心、密度梯度分離和超濾，但目前沒(méi)有被廣泛接受的最佳技術(shù)。這篇文獻(xiàn)介紹了使用離心、浮力密度和超濾方法的組合從細(xì)胞條件培養(yǎng)基和生物體液中分離外泌體的工作流程。

   以體液（血清）外泌體富集為例，首先利用常規(guī)的梯度離心、超速離心得到富含外泌體的沉淀，如下圖，

   說(shuō)明：圖中黑圈面積/外圈圓面積代表外泌體的純度

   接著將超離的到的含外泌體的pellet通過(guò)超濾法或密度梯度離心法進(jìn)行純化，

   細(xì)胞條件培養(yǎng)基外泌體的分離大體雷同，

   詳細(xì)protocol請(qǐng)翻閱原文文獻(xiàn)，文中也有很多notes。各文獻(xiàn)的大體方法基本一致，超速離心是比較好的富集外泌體的方法、要想得到純度高的外泌體需進(jìn)一步用密度梯度離心。小編個(gè)人覺(jué)得對(duì)于Protocol的細(xì)節(jié)，大家需根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行調(diào)整，不能完完全全依葫蘆畫(huà)瓢，不同細(xì)胞的細(xì)胞上清品質(zhì)不一樣，不同離心機(jī)、甚至同一離心機(jī)不同轉(zhuǎn)子操作細(xì)節(jié)都不一樣。

   二、從母體循環(huán)中分離胎盤(pán)特異性外泌體的方法

   Lai, A., et al. (2018). "Optimized Specific Isolation of Placenta-Derived Exosomes from Maternal Circulation." Methods Mol Biol 1710: 131-138.

   包括胎盤(pán)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞均可分泌外泌體。有趣的是，胎盤(pán)細(xì)胞分泌的外泌體早在妊娠6周就已在母體循環(huán)中被發(fā)現(xiàn)，其濃度隨胎齡增加而增加。雖然人們?cè)絹?lái)越有興趣闡明在正常和復(fù)雜的妊娠（如先兆子癇）中外泌體的作用，但由于不能從胎兒外周分離胎盤(pán)外泌體而導(dǎo)致該領(lǐng)域的進(jìn)展被推遲。因此，這篇文獻(xiàn)描述了一個(gè)從母體循環(huán)中分離胎盤(pán)外泌體的工作流程。

   侵入人類白細(xì)胞抗原-G+（HLA-G+）絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞（EVT）是胎盤(pán)錨定基礎(chǔ)，是子宮螺旋動(dòng)脈開(kāi)放以及防止母體對(duì)外來(lái)胎兒和胎盤(pán)組織產(chǎn)生免疫攻擊的關(guān)鍵因素。孕早期，EVT與母體循環(huán)直接接觸；因此，EVT衍生的外泌體可能存在于母體循環(huán)中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)來(lái)源的外泌體具有合胞體滋養(yǎng)層特異性蛋白——胎盤(pán)堿性磷酸酶（PLAP）。此外，研究已經(jīng)確定PLAP陽(yáng)性外泌體僅存在于孕婦的循環(huán)中。這篇文獻(xiàn)描述了一種通過(guò)免疫親和捕獲法從母體循環(huán)中分離胎盤(pán)外泌體的方法，使用抗HLA-G和抗PLAP包被的珠分離絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（HLA-G+）和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（PLAP+）分泌的外泌體。

   三、利用體外培養(yǎng)人胎盤(pán)外植體體系提取胎盤(pán)細(xì)胞外囊泡

   Tong, M. and L. W. Chamley (2018). "Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Ex Vivo Cultured Human Placental Explants." Methods Mol Biol 1710: 117-129.

   人胎盤(pán)外植體的離體培養(yǎng)為胎盤(pán)學(xué)家研究胎盤(pán)在整個(gè)妊娠期間分泌的可溶性因子的環(huán)境提供了基礎(chǔ)，同時(shí)可保持胎盤(pán)絨毛的正確的三維結(jié)構(gòu)。這篇文獻(xiàn)詳細(xì)介紹了使用胎盤(pán)外植體培養(yǎng)方法收集由人類胎盤(pán)釋放的細(xì)胞外囊泡的方法，包含從妊娠6周起的整個(gè)懷孕期間。使用這種方法，可以從每個(gè)胎盤(pán)樣品同時(shí)收集至少三個(gè)不同的胎盤(pán)細(xì)胞外囊泡群，從而可對(duì)由人類胎盤(pán)產(chǎn)生的不同類型的細(xì)胞外囊泡的成分和下游效應(yīng)進(jìn)行比較分析。

   對(duì)于研究胎盤(pán)外泌體的童鞋們，上面這2篇文獻(xiàn)應(yīng)是必讀文獻(xiàn)吧。

   四、外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析

   Lai, A., et al. (2018). "Proteomics Method to Identification of Protein Profiles in Exosomes." Methods Mol Biol 1710: 139-153.

   母體循環(huán)中存在的外泌體水平在先兆子癇懷孕中較高，并且其蛋白質(zhì)含量分布響應(yīng)于微環(huán)境而變化。通過(guò)發(fā)現(xiàn)候選生物標(biāo)志物，基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)可以更好地理解懷孕相關(guān)疾病的病理生理學(xué)。隨著樣品制備技術(shù)、計(jì)算方法學(xué)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)解決了鑒定和量化來(lái)自各種復(fù)雜生物樣品的數(shù)千種蛋白質(zhì)和肽的挑戰(zhàn)。盡管對(duì)生物標(biāo)志物診斷的興趣越來(lái)越濃，生物基質(zhì)（例如血漿）的復(fù)雜性質(zhì)對(duì)候選生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提出了挑戰(zhàn)。這篇文獻(xiàn)描述了一個(gè)制備用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的外泌體的工作流程。

   做外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析的小伙伴們可以看看這篇文獻(xiàn)。

https://www.exosomemed.com/3811.html

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